作为第三代EGFR抑制剂的奥西替尼，其作用重点在于EGFR敏感突变和T790M耐药突变此二者，而且对于其他激酶靶点呈现出较低活性，接下来会针对其作用靶点进行具体深入分析。

奥西替尼主要针对的核心靶点，集中于EGFR激酶结构域，它通过共价结合C797残基这种特别的方式，能够以不可逆的形式，对EGFR 19外显子缺失、L858R这类敏感突变情形实行抑制，与此同时，它对于T790M耐药突变呈现出高度的选择性，针对其抑制强度处于纳摩尔级别，恰恰是这种双突变抑制特性，成为它得以克服一二代药物耐药问题的关键之处。

奥西替尼，除了主要靶点之外，研究表明，它对ERBB2（HER2）、ERBB4（HER4）此类HER家族成员有着较弱的抑制作用。在浓度比较高的时候，此药可能会对BLK、BMX等非受体酪氨酸激酶造成影响。然而，这些交叉活性拥有的临床意义，目前还不明确 ，一般状况下并不被当作治疗的主要机制。

需要留意的是，奥西替尼对待野生型EGFR呈现出的抑制活性，相对突变型明显低很多。就是这种特性，让它跟前代药物相比，有了更优的安全性谱。在药物研发过程里，通过优化分子结构这个行动，进一步达成了降低其对IGF - 1R、INSR等胰岛素信号通路相关激酶的脱靶效应这个目的。